推荐产品

  • 名称: Reverse Transcriptase Kit
货号:Cat#083201
规格:20次/袋
价格:320

产品介绍

  

产品介绍: 

本产品反转录酶M-MLV为重组表达获得,采用最新专利技术以RNA为模版,更高效反转录获得cDNA片段。



应用范围

1、cDNA第一链的合成

2、cDNA文库的构建

3、适用于二级结构复杂的RNA



产品成分(所有成分请置于-20゜C长期保存)

1、M-MLV Reverse Transcriptase (200 U/μl,20μl)

*使用时请置于冰盒内或冰上,避免室温长时间放置降低酶活

2、5×M-MLV Reverse Transcriptase Buffer(1mL)

3、dNTP Mixture(10mM each,30μl)

4、Random  6  mers (50μM,30μL)

5、Oligo dT15 Primer(50μM,30μL)

6、RNase Free Water(DEPC Water)




操作步骤

1、模板RNA在冰上解冻;引物、5×M-MLV Reverse Transcriptase Buffer、dNTP Mixture和RNase-free Water在室温( 15-25℃) 条件下解冻, 解冻后迅速置于冰上。 使用前将每种溶液涡旋振荡混匀, 简短离心以收集残留在管壁的液体。

2、按照下表的体系在冰浴的无核酸酶的离心管中配制混合液:

组分                        体积

RNA                        1ng~2μg Total RNA

Primer                        1μL Random 6 Primer(50μM)或1μL Oligo dT15 Primer(50μLM)

dNTP(10mM)                1μL

5×Reverse Transcriptase Buffer 4μL

M-MLV Reverse Transcriptase 1μL

Rnase Free Water        补充至20μL

3、在PCR仪中42℃孵育60min,然后72℃加热5min终止反应,置于冰上进行后续实验或冷冻保存。




注意事项:

1、避免反复冻融样本RNA,刚制备的完整性好、 纯度高的RNA作为模版为最佳。

2、在使用Random Primer时,请注意随机引物量和总RNA量之间的关系,一般建议50 ng随机引物/5 μg总RNA。 当提高Random/RNA的比率将会提高短片段(~500 bp) cDNA的合成;而当降低Random/RNA的比率将会提高长片段cDNA的合成。

3、如果模板RNA富含二级结构, 可以先在65℃条件下预处理5 min。

4、如果反转录中使用PCR下游引物,为了防止引物错配导致的非特异扩增, 可以在50℃条件下进行反转录。

5、在进行长片段扩增时,建议70℃处理15 min灭活酶。